Vzorky krve, plazmy a séra
Prvním stupněm každého testování je preanalityka. Skládá se kroků, jako je příprava pacienta, odběr vhodného materiálu, přeprava vzorků do laboratoře a jejich příprava k analýze.
Příprava pacienta
Před samotným odebráním vzorku by zvíře nemělo jíst po dobu 10-12 hodin. V případě, že zvíře půst nedodrží, může dojít k nesprávným výsledkům. To platí zejména u následujících parametrů: cholesterol, glukóza, TLI, amylázy, ALT, AST, bilirubin, celkové bílkoviny, triglyceridy, žlučové kyseliny, vápník a leukocyty.
Majitel zvířete by měl být informována o tom, že fyzická aktivita může mít významný vliv na výsledky krevních testů kvůli zvýšení úrovně glukózy, laktátu, CK, LDH a AST.
Popis vzorku
Žádanka i vzorek by měli být jasně označeni jménem zvířete nebo jménem majitele.
V případě funkčních testů je důležité udat přesný čas odběru vzorku. U testů, kde se materiál odebírá vícekrát v intervalu několika hodin (např. stimulační testy), je důležité označení posledního vzorku.
Jaký druh materiálu budete potřebovat k testování?
Informace o požadovaném materiálu (krev, sérum, plazma) jsou uvedeny na žádance u každého objednávaného testu.
EDTA krev
- EDTA krev je u savců nejvhodnější materiál ke stanovení krevního obrazu a vytvoření krevního nátěru.
- U plazů a ptáků je pro hematologické vyšetření ale obecně vhodnější LiHep krev.
- K vyšetření biochemických a sérologických parametrů se odběr krve na EDTA až na výjimky nedoporučuje, jelikož EDTA (vychytávač 2 důležitých iontů) může tyto analýzy ovlivnit.
Sérum
- Pro získání séra se krev odebere do zkumavek bez antikoagulantu.
- Po odběru se krev nechá stát po dobu cca. 15-30 minut (s výjimkou konkrétních testů, u kterých musí být krev během 20 minut po odběru být ochlazována a odstředěna, aby bylo možno provést označení).
- Odstřeďování – 5 minut při 4000 otáčkách / min.
- Výsledná separace séra do prázdné zkumavky.
Plazma
- Plasma je odebrána do zkumavky s vhodným antikoagulantu (EDTA, heparin, citrát).
- Poznámka: Přítomnost antikoagulantu omezuje rozsah analýzy vzorku!
- Krev může být centrifugován ihned po odběru (10 min, 3000 ot./min.).
Plná krev
- Nejlepší materiál pro biochemické a sérologické séra.
- Pokud nelze připravit vzorek séra, mějte na paměti, že ne všechny parametry lze z plné krve stanovit (např. glukóza).
- Jelikož při transportu plné krve může dojít k poškození membrány erytrocytů a následnému hemolytickému poškození vzorku, zasílejte plnou krev pouze ve výjimečných případech (malé množství vzorku, krevní obraz – viz výše).
Faktory narušující analýzu
Hemolýza
Hemolýzou rozumíme únik obsahu erytrocytů při poškození buněčné membrány těchto krevních buněk. Vedle fosfátu, železa a draslíku jmenujme hlavně hemoglobin. Červené zabarvení séra/plazmy, které je dané právě hemoglobinem, narušuje v prvé řadě ta biochemická vyšetření krve, která jsou založena na fotometrii.
Zvýšené hodnoty:
LDH, CK, AST, bilirubin, AP, kreatinin, Ca, glukóza, PO4 , K, Mg, Fe, fruktosamin, hemoglobin
Lipémie
Lipémií rozumíme mléčné zakalení séra/plazmy neutrálními tuky. Důvodem lipémie může být nedodržení hladovky před odběrem nebo stres.
Zvýšené hodnoty:
ALT, AST, AP, bilirubin, glukóza, Ca, PO4 , celkový protein, lipid, hemoglobin
Snížené hodnoty:
albumin, amyláza, Na, Cl, K, PO4
Ikterus (žloutenka)
Ikterem rozumíme žluté zabarvení séra/plazmy. Přebytek bilirubinu, který je příčinou žlutého zabarvení vzorku, je zpravidla podmíněn onemocněním organismu a není ovlivnitelný.
Zvýšené hodnoty:
AP, celková bílkovina, Cl, PO4
Snížené hodnoty:
triglyceridy, kreatinin, Mg
Léky
Vliv některých léků na biochemické parametry:
Penicilin G – K ↑
Tetracyklin – ↓ K, PO4
Salicylát – CK ↑, ↑ ALP, ↑ glukóza, ↑ Na, ↑ celková bílkovina, ↓ K, ↓Ca
Kortikosteroidy – CK ↑, ↑ ALP, ↑ glukóza, ↑ Na, ↑ celková bílkovina, ↓ K, ↓Ca
Barbituráty – CK ↑
Fenylbutazon – Ca ↑, ↑ Na
Halotan (narkóza)- CK ↑, ↑ PO4
Glukóza (infuze) – glukóza ↑, ↓ PO4
Doplňující informace
EDTA nebo lithium-heparinová krev
Při odběru vzorku nejlépe prvních 0,5 ml nenabírat, jelikož se zde nachází zvýšené množství srážecích faktorů nebo odebrat nejprve krev na sérum.
- Krev nechat pomalu stékat po stěně zkumavky.
- Dodržovat doporučené množství odebrané krve.
- Po skončení odběru zkumavku pomalu několikrát otočit.
- Pokud předpokládáte u pacienta koagulopatii, proveďte ihned po odběru krevní nátěr.
- V zimě zabalte zkumavku do obalu, který zabrání zmrznutí vzorku, v létě ev. chlaďte.
Stanovení glukózy a laktátu
- Možné pouze z natrium-fluoridové nebo natrium-oxalátové krve.
Srážecí parametry
- Vyšetření se provádí z natrium-citrátové plazmy, která se získává z krve odebrané na Na-citrát v poměru 9:1 (9 dílů krve + 1 díl natrium-citrátu).
- Odstředění proveďte na místě.
- Pokud nabíráte vzorek krve do komerční citrátové zkumavky, striktně dodržujte plnění po značku na zkumavce.
- Nemáte-li k dispozici komerční náběrové citrátové zkumavky, můžete použít injekční stříkačku vylitou 3,13% natrium-citrátem.
Mikrobiologie
Aby se zabránilo kontaminaci fyziologickou mikroflórou, že je velmi důležité, aby bylo s materiálem zacházeno co nejvíce sterilním způsobem.
Přenos materiálu:
- Stěry pro bakteriologické a mykologické testy – transportní médium.
- Moč – Na Uricult nebo do sterilních zkumavek.
- Vlasy a kožní stěry na dermatofyty – v papírových sáčkách nebo v alobalu.
- Výkaly ve speciálních zkumavkách.
Histologie a imunohistologie
Při zasílání vzorků tkání k patohistologickému nebo imunohistologickému vyšetření je potřeba dodržet následující pokyny:
- Dostatečně velký vzorek (průměr > 0,5 cm) typicky změněné tkáně bez poškození způsobeného odběrem.
- Okamžitá fixace (4-10% neutrálně pufrovaný formaldehyd).
- Zhotovit předběžnou zprávu pro patologa s otázkami a klinickým obrazem pacienta.
- Zaslání vzorku v odpovídající nádobě (na požádání zdarma dodáme).
- Ze zaslaného vzorku je po patohistologickém vyšetření možné následně provést i imunohistologické vyšetření.
Podrobnosti
Vzorkem rozumíme reprezentativní část tkáně bez preparačních artefaktů (např. natržení, pohmoždění, elektrokoagulace). Je nutné dodržet průměr vzorku alespoň 0,5 cm. Výjimku tvoří vzorky, kdy není technicky možné dodat větší rozměr (např. endoskopicky odebrané vzorky žaludeční sliznice). Je třeba myslet na fakt, že malé vzorky nepodávají dostatek informací, ale naopak moc velké vzorky jsou často nedostatečně profixované. Obecně je ideální délka hrany vzorku zhruba 1 cm, potřebná velikost se ale liší podle dle požadovaného vyšetření, místa odběru a přítomných tkáňových změn. Malé léze by měly být uloženy ve vzorku centrálně, aby nebyly přehlédnuty a byly vyšetřeny. V případě nejasností je dobré zaslat více vzorků.
Kožní biopsie
Vzorkem kůže pro účely kožní biopsie rozumíme část kůže se všemi kožními vrstvami s průměrem ne menším než 0,5 cm. Je nutné odebrat primární změny z několika míst. Bioptované místo by nemělo být narušeno žádným holením (místo je možné ostříhat) nebo seškrabováním. V předběžné zprávě je dobré uvést všechny relevantní informace, které jsou důležité pro stanovení diagnózy. Je vhodné využít předpřipravený laboratorní patolohistologický vyšetřovací protokol, který je zaměřen právě na kožní bioptáty a tumory, ale skýtá i možnost doplnit další informace z Vaší strany.
Cytologie
Vzorky pro cytologické vyšetření mohou být odebrány punkcí (např. likvor punkce s/bez aspirace), seškrabem nebo otiskem. Nejčastější technikou odběru je tenkojehelná aspirace. Používá se stříkačka s nasazenou jehlou (G22-G27). Po vpichu vytvořte podtlak a tkáň propíchněte ideálně do několika směrů. Před vysunutím jehly ze tkáně přerušte podtlak, aby nedošlo k nasátí vzorku do stříkačky. Následně pomocí přetlaku (vzduch nasátý zvlášť do stříkačky) přeneste vzorek z jehly na okraj podložního sklíčka. Druhé podložní sklíčko položte v pravém úhlu na sklíčko s odebraným materiálem a opatrně táhněte ke straně, tak vznikne roztěr. U tekutých vzorků použijte druhé podložní sklíčko stejně jako při vytváření krevního nátěru, tzn. přiložte ho v úhlu 45° ke vzorku na prvním podložním sklíčku a proveďte roztěr materiálu (tahem).
Pro přípravu cytologického preparátu z punktátů, exkretů nebo sekretů je potřeba získané tekutiny odstředit při 1 500 otáčkách/min po dobu 3-5 minut. Po odstředění opatrně odlijte ze zkumavky tekutinu nad usazeninou a poté proveďte nátěr (viz. krevní nátěr) materiálu nasátého z usazené vrstvy. Nátěr nechte uschnout na vzduchu. Pokud zasíláte přímo punktát, použijte k zaslání vzorku EDTA zkumavku. Při tvorbě cytologického vzorku z výtěru pochvy je potřeba tampón (ev. cytologický kartáček) rolovat přes sklíčko, neroztírat.
Všechny nátěry je vhodné nechat uschnout při pokojové teplotě, zasílejte je nefixované a nebarvené. Nejdůležitější je vytvořit tenký nátěr s jednou vrstvou buněk (monolayer). Příliš tlusté nátěry jsou nejčastější příčinou nedostatečné kvality posouzení, resp. nemožnosti posouzení zaslaného cytologického vzorku.
PCR vyšetření
Patogen ve fázi virémie, parazitémie nebo bakteriémie může být prokázán přímo z EDTA krevního vzorku. Lithium-heparinová krev je pro toto vyšetření nevhodná, jelikož může PCR blokovat.
Oproti vzorkům pro bakteriologickou/mykologickou kultivaci, je pro PCR vyšetření vzorků důležitý sterilní odběr tampónem bez transportního média. Při malé koncentraci patogenu ve vzorku může docházet k falešně negativním výsledkům. Odběrový tampón můžete před použitím navlhčit fyziologickým roztokem.
Pro PCR vyšetření jsou vhodné i kartáčky, tzv. cytobrush, které je vhodné zasílat ve sterilních, neošetřených zkumavkách.
Další vzorky jako např. kožní biopsie, části orgánů, moč, synovie, likvor, kostní dřeň a punktáty mízních uzlin je nejlepší zasílat na PCR vyšetření ve zkumavkách bez aditiv.
